ИНДИКАТОРНЫЙ МЕТОД
Спасибо нашим инвесторам из казино онлайн
ИНДИКАТОРНЫЙ МЕТОД
определения рН, колориметрическое измерение активной реакции раствора по окраске прибавленного к нему индикатора, представляющего собой слабую кислоту или слабую щелочь (см.
Индикаторы).
Чем бблыпую константу диссоциации имеет кислотный индикатор, тем более высокая концентрация Н-ионов требуется для того, чтобы подавить его диссоциацию и вызвать изменение окраски; то же относится к щелочным индикаторам и ОН-ио-нам. Поэтому разные индикаторы изменяют свою окраску при различных рН, к-рые мо-. гут довольно далеко отклоняться от нейтральной точки как в кислую, так и в щелочную сторону. То значение рН, при к-ром степень диссоциации индикатора равна половине, называется его точкой перехода. В этой точке он имеет промежуточную окраску между теми, которые он принимает в резко кислой или щелочной среде, т. е. в недиссо-циированном или же во вполне диссоциированном состоянии. По обе стороны от точки перехода окраска индикатора б. или м. резко изменяется. Это т. н. зона перехода, или зона виража индикатора. Она представлена в след. таблице для нескольких наиболее употребительных индикаторов. рН раствора Метилоранж Метил-рот «-нитрофенол Нейтраль-рот а-на – фтол – фта – леин Фенолфталеин Цвет и н д и к а т о р а 2 . . краен. — — — — — 3. . оранж.-красн. фиол,-красн. — — — — 4. . оранш. краен. — — — — 5. . желт. оранш. бесцв. — — — 6. . — желт. зеленоватый краен. — — 7. . — — . зелено-желт. розов. бесцв. — 8. . — — — оранш. зеленоватый бесцв. 9 . . — — — | желт. синий розов. 10. . — — — I — . краен. Исследуя данный раствор серией индикаторов, имеющих различные, последовательно друг от друга отличающиеся зоны виража, можно приближенно определить его рН. Напр. если метилоранж принимает в исследуемом растворе желтый цвет, его рН должно быть не ниже 5; отсутствие покраснения фенолфталеина покажет, что рН не превышает 8 (вернее—8,2); зеленоватая окраска а-нафтолфталеина заставит приписать рН приблизительно это последнее значение. Буферный метод. Однако после такого предварительного определения, найдя подходящий индикатор, в зоне виража которого лежит искомое рН, для его точного измерения необходимо произвести колориметрическое сравнение окраски индикатора в данном растворе с его цветом в растворах заранее известной реакции. Для этого пользуются буферными смесями (см.
Буферные свойства)
, при помощи к-рых готовят серию стандартных растворов с равномерно меняю – щейся активной реакцией. Их рН легко может быть вычислено по соответствующим формулам или же найдено по опубликованным рядом авторов таблицам. Впрочем при тщательном исследовании во избежание неточностей, возможных при приготовлении буферных растворов, последние следует проверять при помощи водородной цепи (см.
Газовая цепь),
представляющей основной и наиболее точный метод измерения рН. Точность колориметрического измерения не превышает обычно 0,05 рН. Определение несколько усложняется в случае окрашенных или мутных жидкостей, собственная окраска к-рых суммируется с окраской индикатора. В этом случае, чтобы произвести колориметрическое сравнение окраски индикатора в испытуемом и в стандартном растворе, позади последнего на пути световых лучей в качестве «ширмы» помещают равный слой исследуемой жидкости (без индикатора). Она играет роль светофильтра и совершенно так же действует на цвет проходящих лучей, как если бы она находилась в одном Вода Исследуемая! жидкость | Исследуемая жидкость Стандартный раствор
+
индикатор Схема I. растворе с индикатором. Благодаря этому остроумному приему, предложенному Уол-полем (Walpole), устраняется влияние естественного пигмента на результат колориметрического сравнения. На схеме I изображено расположение растворов и на рисунке — простой прибор, так называемый компаратор, обычно применяемый для измерения (чистая вода помещена позади исследуемого раствора для того, чтобы поглощение света водой также было одинаково в обоих случаях). Безбуферный метод. Нек-рым видоизменением и упрощением обычного И. м. измерения рН является безбуферный метод, предложенный Гилс-паем (Gillespie). Изменение окраски индикатора зависит от изменения степени его диссоциации. Последняя выражается кривой диссоциации, причем Соотношение капель щелочь : к-та каждому рН соответствуют определенная точка кривой данного индикатора и определенная его окраска. Вместо того, чтобы измерять рН при помощи стандартных буферных растворов, можно найти его, непосредственно определив степень диссоциации индикатора. Поместим для э
того на пути светового луча два раствора индикатора—кислый и щелочной. В одном из них все молекулы индикатора будут в диссоциированном, в другом— в недиссоциированном состоянии. Световой луч, пройдя через оба раствора, очевидно приобретет такую же окраску, как если бы диссоциированные и недиссоциирован-ные молекулы индикатора находились вместе в одном растворе. Приготовим например с данным индикатором следующие девять пар растворов: 1) 1 капля индикатора в щелочном растворе и 9 капель в кислом, 2) 2 капли в щелочном и 8 капель в кислом.,!)) 9 капель в щелочном и 1 капля в кислом. Путем колориметрического сравнения найдем теперь при каком распределении индикатора между кислой и щелочной жидкостью получится окраска, тождественная с окраской 10 кап. индикатора в исследуемом растворе. Расположение растворов изображено на схеме II; для получения его пользуются компаратором. Уолполя, описанным выше. Полученное соотношение непосредственно дает степень диссоциации индикатора, а следовательно и рН раствора.
i
&
I
трофенолы; в растворе, более кислом, чем их зона перехода, они бесцветны. Поэтому Вода Исследуемая жидкость + 10 капель индикатора Кислый раствор + (10—п)капель индикатора Щелочной раствор + п капель индикатора Схема
II.
Если индикатор представляет слабую кислоту, то в щелочном растворе образуемая им соль полностью диссоциирована. Распределение индикатора между щелочным и кислым раствором, равное напр. 3:7, соответствует степени диссоциации 0,3. При соотношении 5 :5 степень диссоциации равна 0,5, а рН равняется точке перехода данного индикатора. Для нескольких индикаторов определяемые таким образом значения рН приведены в таблице (по измерениям Гилс-пая, для 25—30°). Измерение еще больше упрощается при пользовании одноцветными индикаторами, у к-рых только одна форма окрашена, другая же совершенно бесцветна. Таковы напр. фенолфталеин и различные нитро – и дини – Бром – фенол – блау Метил-1. рот Бром-:крезол-пурпур Бром-тимол-блау 3,1 3,5 3,7 3,9 4,1 4,3 4,5 4.7 5,0 4,05 4,4 4,6 4,8 5,0 5,4 5,6 5,95 5,3 5,7 5,9 6,1 6,3 6,5 6,7 6,9 7,2 6,15 6.5 6,7 6,9 7,1 7.3 7^5 7.7 8,05 Фенол – Кре – Тимол – рот зол-рот блат 6,75 7,15 7,85 7Д 7,5 8,2 7,3 7,7 8,4 7,5 7,9 8,6 8,1 8,8 7,9 9,0 8,1 8,5 9,2 8,3 8,7 9,4 8,65 9,05 9,75 задние растворы на схеме II могут быть отброшены. Степень диссоциации индикатора в данном случае просто равняется отношению его количества в щелочном растворе к его содержанию в исследуемом растворе (конечно при условии, если индикатор представляет слабую одноосновную кислоту). В виду того, что нитрофенолы и динитрофе-нолы отличаются среди одноцветных индикаторов значительной стойкостью, Михаелис (Michaelis) предложил готовить из них по описанному здесь способу постоянные серии растворов (содержащие различные количества данного индикатора в щелочной среде), сравнение с к-рыми непосредственно дает искомое рН. Безбуферный метод и описанные его упрощения особенно удобны для быстрого ориентировочного измерения реакции. Колориметрия тканей. Для измерения рН берут обычно 5—10
см3
исследуемого раствора. Уменьшая размеры компаратора, можно понизить это число до 1 еж3. Чтобы измерить еще меньшие колич., напр. одну каплю жидкости, ее сравнивают с серией капель стандартных смесей, прибавляя к ним по возможности одинаковые капли индикатора. Различия окраски более заметны, если наблюдать их на чистом белом фоне, например на белой фарфоровой пластинке. Греф (Graff) воспользовался этим приемом для измерения реакции тканей, маленькие кусочки которых он быстро растирал для освобождения тканевого сока. Однако такое раздавливание тканей вызывает значительное посмертное смешение их реакции (в кислую сторону) и не дает правильного представления о рН живой ткани (более грубые различия между рН различных тканей все же могут быть этим способом уловлены). Ошибка может быть значительно уменьшена, если раздавливаемую ткань предварительно сильно охлаждать и замораживать (жидким воздухом). При этом однако метод Грефа, не делаясь вполне надежным и безупречным, теряет свое главное преимущество—простоту и легкость выполнения. Избежать опасности посмертного изменения внутриклеточной реакции можно только измеряя рН живой ткани. Это оказалось возможным с развитием микрургиче-ских методов (см.
Микрургия),
позволяющих вводить в живую клетку любые (неядовитые для нее!) индикаторы. Шмидтман (Schmidt-mann), производя укол клетки микроиглой, вводила приклеенную к последи, крупинку сухого, растворимого в воде индикатора. Окраска, которую принимал клеточный сок, прилегающий к индикатору и частично его растворяющий, сравнивалась с окраской,
которую сообщала такая же крупинка индикатора различным буферным растворам. Другие исследователи (Chambers и его сотрудники, D. и J. Needham и др.) инъици-ровали в клетку капельку раствора индикатора известной концентрации. Пользуясь серией индикаторов, имеющих яркие и резко изменяющиеся цвета и достаточно близкие точки перехода, можно с достаточным приближением установить рН яшвой клетки или даже отдельных ее частей. Ошибки И. м. При пользовании индикаторами необходимо учитывать ряд условий, способных б. или м. значительно исказить результаты измерения. Это прежде всего — концентрация самого индикатора. Индикаторы представляют собой не нейтральные вещества,—чаще всего это кислоты. В случае малой буферности раствора их прибавление может значительно сместить первоначальную реакцию. Это влияние, естественно, будет тем сильнее, чем выше концентрация индикатора. При исследовании жидкостей, имеющих очень малую буферную емкость (напр. чистая вода), следует поэтому ограничиваться возможно малыми количествами индикатора. На зону виража индикатора влияет также температура раствора. Впрочем при пользовании буферным методом это влияние можно элиминировать, т. к. оно одинаково в исследуемой жидкости и в служащем для сравнения растворе. Необходимо только знать рН соотв. буферных растворов при данной t°. При безбуферном методе изменением точки перехода с температурой—если изменение последней достаточно велико — нельзя пренебрегать. Значительно большую роль играет т. н. солевая ошибка индикаторов. Все индикаторы в большей или меньшей степени изменяют свою степень диссоциации и точку перехода в присутствии солей. Индикаторы, у к-рых это влияние сильно, совершенно непригодны для исследования растворов, богатых солями, например морской воды. Но и для всех остальных приходится вводить в этом случае соответствующую поправку, величина которой в наст, время для многих индикаторов известна. Труднее поддается учету—и поэтому гораздо опаснее—белковая ошибка. В присутствии различных белковых тел и продуктов их распада индикаторы могут давать совершенно неправильные показания. Некоторые из них оказываются в этих условиях абсолютно непригодными, другие — недостаточно точными. Так как соединение белковых веществ с индикаторами, вызывающее белковую ошибку, происходит постепенно, то индикатор немедленно после прибавления может давать в течение нескольких мгновений более правильное показание, после чего его окраска быстро меняется. Т. о. только при отсутствии белков и продуктов их распада, а также больших количеств солей, колориметрические методы дают достаточно надежные результаты. При наличии же этих веществ только применение водородной цепи позволяет в каждом случае установить пригодность того или иного индикатора и величину соответствующей поправки.
Лит.:
Домонтович М., Определение концен трации водородных ионов, М., 1926; G r all S., Ein Verfahren zur Bestimmung der Wasserstoffionenkon-zentration im G-ewebe mit Indikatoren, Beitr. z. pathol. Anat. und. allg. Pathol., B. LXXII, 1924; Ко lt-hoff J., Der Gebrauch von Farbindikatoren, В., 1926; Kooaczewski W., Les ions d’hydrogene, P., 1926; Mislowitzer E., Die Bestimmung der Wasserstoffionenkonzentration von Fliissigkeiten, В., 1928; Pfeiffer H., Der gegenwartige Stand dec kolorimetrischen Azidometrie in der Gewebephysiologie, Protoplasma, B. I, 1927. Д. Рубинштейн.