ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА
Спасибо нашим инвесторам из казино онлайн
ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА
. Содержание: Методика гистологич. исследований. 242 Теоретические основы Г. т. 246 Гистохимия. 253 Краски, употребляемые в Г. т. 258 Гистологическая техник а—техника изучения микроскоп, строения клеток, тканей и органов растений и животных. Отдел Г. т., посвященный строению клетки, обозначается обычно как цитологическая техника.—Наиболее простым и во многих случаях чрезвычайно ценным методом Г. т. является изучение нативного материала, т. е. живых или свежих, переживающих гист. элементов или клеток. Это возможно однако лишь в случае очень мелких и прозрачных объектов, напр. клеток крови и др., а также тонких тканевых пленок вроде брыжейки низших позвоночных и т. п. Нередко применяется и метод расщипывания свежих тканей на отдельные элементы, напр. при изучении мышцы, нервн. волокон и т. п. Во многих случаях непосредственное исследование живой ткани может дать чрезвычайно много и служит основой для правильной оценки результатов обычных методов Г. т. Наблюдение в живом состоянии дает нередко много для понимания физиологического значения различных структур, например скелетных и сократительных элементов и т. п. Однако в большинстве случаев непосредственное изучение нативного материала затруднено либо непрозрачностью, либо оптической однородностью изучаемых объектов. Последнее зависит от того, что лучепреломление и лучепоглощение различных гист. структур крайне близко; поэтому их оптическая диференцировка б. ч. крайне трудна. Однако, применяя т. н. фиксаторы, вызывающие свертывание белковых и др. составных частей протоплазмы, можно достичь того, что различные тканевые элемен – ты образуют коагуляты, имеющие неодинаковый коефициент преломления. Это дает возможность проявить многие гисто – и цитологические элементы, напр. ядра, ядрышки. волокна, очень простыми способами, напр. прибавлением уксусной или осмиевой кислоты и т. п. Однако получающаяся при этом оптическая диференцировка далеко не совершенна, и в большинстве случаев наиболее тонкие морфологич. детали могут быть выявлены лишь с помощью разных окрасок. Окрашивание возможно только в случае мертвых тканей, т. к. живые клетки совершенно не красятся, а могут лишь накоплять краски в вакуолях протоплазмы (см.
Витальная окраска).
Поэтому клетки должны быть предварительно законсервированы или зафиксированы, т. е. умерщвлены, но так, чтобы по возможности не нарушить естественных морфолог, соотношений и не вызвать грубых
артефактов
(см.). Гистолог. объекты рассматриваются под микроскопом гл. обр. в проходящем свете,—реже—в поляризованном (падающим светом практически не пользуются). Для некоторых спец. целей применяется микроскопия в темном поле зрения. Для исследования в проходящем свете объекты должны быть достаточно прозрачны. Поэтому задачей Г. т. является приготовление очень тонких препаратов. Т. о. Г. т. сводится к фиксации клеток или тканей, к приготовлению срезов и к их окрашиванию. При изучении отдельных гист. элементов, свободных или полученных путем расщипывания, можно обойтись тотальными препаратами, минуя приготовление срезов. Методика гиет. исследований. Фиксация. Цель фиксации—быстрое умерщвление ткани путем свертывания белка (и отчасти липоидов) при возможном сохранении естеств. морфологии строения. Первоначально значение фиксации видели в уплотнении мягких тканей с тем, чтобы из них можно было делать тонкие срезы. Однако известны многие уплотняющие вещества, хотя и свертывающие белок, но все же непригодные в качестве фиксаторов, так как они вызывают большие структурные изменения. Фиксаторами являются прежде всего—соли тяжелых металлов: Hg, Сг, Os, Pt; из кислот—пикриновая, уксусная, трихлор-уксусная, затем спирт, ацетон, формол и некоторые другие вещества. Только три последние употребляются как самостоятельные фиксаторы, в большинстве, же случаев применяются самые разнообразные смеси, так как т. о. достигаются наилучшие результаты. Наиболее распространены жидкости Флемминга, Ценкера и Буена. Пробыв в фиксаторе нек-рое время, от нескольких мин. до нескольких дней (каждый фиксатор имеет свой оптимум времени), кусочки тканей должны быть в большинстве случаев отмыты от фиксирующей жидкости. Это достигается промыванием в воде или в спирте.—Этим заканчивают 1-ю операцию и приступают к приготовлению срезов. Но если в кусочках имеются твердые ткани, как кость, хитин или же пат. отложения извести, то их предварительно размягчают; так, известковые элементы растворяются кислотой (см.
Декальцинация),
i> хитин размягчается диафанолом (двуокись хлора, растворенная в уксусной к-те) или кедровым маслом. Простейшим методом приготовления срезов является разрезание кусочков от руки обычной бритвой для бритья. Этот метод очень широко применяется в ботанике и до сих пор. На ботанических объектах такое изготовление срезов без дальнейшей обработки (и даже без фиксадии) возможно потому, что растительные ткани относительно очень плотны; в случае животных объектов этот метод применяется крайне редко. На первых порах развития техники срезов применяли разрезание в печени, при чем кусочек зажимался между 2 пластинками свежей печени, и разрез проводился через всю массу. В наст, время для приготовления срезов пользуются
микротомами
(см.), позволяющими делать очень тонкие срезы и регулировать их толщину. Наиболее простой способ — резка замороженных кусочков. Кусочек ткани, фиксированный в формоле или других фиксаторах, замораживается (эфиром или жидкой углекислотой) и т. о. примерзает к столику специального микротома. Промерзшие ткани настолько тверды, что позволяют микротомной бритве разрезать их на очень тонкие срезы (до 5
ft).
Срезы тотчас же переносятся в воду, где они оттаивают. Недостатки этого метода: 1) срезы нек-рых тканей крошатся и по оттаивании распадаются; 2) нельзя работать с очень мелкими объектами; 3) почти невозможно приготовить большую серию срезов, т. к. часть их всегда гибнет.— Гораздо более распространена резка кусочков тканей, заключенных в парафин или в целлоидин. При заключении в эти вещества кусочек должен быть предварительно пропитан жидкостью, которая, с одной стороны, смешивалась бы с водой, ас другой—растворяла бы парафин и целлоидин. В случае парафина для этого служат различные углеводороды и их производные: бензол, ксилол, толуол, хлороформ и др., а также различные масла. Обычно кусочек переносят сначала в 50%-ный спирт, затем в 70-э-Эб -*• 100%-ный; далее следуют смеси 100%-ного спирта с возрастающими количествами ксилола, затем чистый ксилол-•>-ксилол, насыщенный парафином (при 37°), и наконец чистый парафин (при 60°), который сменяют обычно 3—4 раза. Парафиновая заливка производится в термостате. Когда кусочек окончательно пропитался, его быстро охлаждают, так как при медленном застывании парафин кристаллизуется. До введения во всеобщее пользование парафина применялось заключение кусочков в мыло. При заливке в целлоидин объект совершенно так же проводят через спирты возрастающей крепости, затем переносят в смесь спирта с эфиром (аа) и наконец пропитывают спирто-эфирными растворами целлоидина восходящей крепости до концентрации 8%. Затем его вынимают, кладут на кусочек дерева или эбонита и переносят в сосуд с парами хлороформа; при этом целлоидин затвердевает. Далее прикрепленный к деревяшке и залитый в целлоидин кусочек погружают в 70 %-ный спирт, где он достигает плотности мягкого хряща. Залитый кусочек называется блоком. В этом сострянии объекты можно сохранять бесконечно долго без всякого. вреда для структур. Обе эти заливки требуют много времени, т. к. в большинстве сред кусочек должен лежать сутки и больше. С помощью микротома удается разложить любой кусочек на срезы от 1,« до 20
/л,
не потеряв при этом ни одного. Из парафиновых блоков можно легко получать ленточки из срезов, благодаря тому, что они при резке своими краями приклеиваются друг к другу. Срезы переносят на слабо подогретую воду, на которой они легко расправляются (они не должны расплавляться). После этого срезы помещают на предметные или покровные стекла и просушивают при 37°, при чем они плотно пристают к стеклу. Перед окрашиванием парафин должен быть удален, для чего предметные стекла с приклеенными срезами погружают в ксилол (или др. вещество), в к-ром парафин растворяется; затем ксилол отмывают в 100%-ном спирте, и через спирты нисходящей крепости срезы доводятся до воды (если предполагают красить водной краской). В случае целлоидиновой заливки приготовленные срезы поступают в 70%-ный спирт и затем в воду; красят их в чашечках. Сам целлоидин в большинстве случаев окраске не мешает, а в случае нужды он легко может быть удален спиртом с эфиром. Окраска. Ее целью является отчетливое выделение различных структур. Исход окраски сильно зависит от предшествовавшей фиксации. Лучшая окрашиваемость достигается поеле спирта, формола, затем сулемы и трихлоруксусной кислоты, после же солей осмия, лучшего из известных фиксаторов, окраска нередко затруднена. Однако можно значительно облегчить окраску, обработав срез перекисью
водорода, удалив так. обр. весь связанный тканью осмий, или продержав срезы в сулеме. Для удачной окраски обычно необходимо полное удаление всех следов фиксатора. Важным фактором окраски является также обработка ткани спиртом (для удаления жиров); при парафиновой и целлоидиновой заливках это достигается в процессе заливки, при резке же на замораживающем микротоме перед окраской очень рекомендуется положить срезы на нек-рое время в алкоголь. При окрашивании имеет первенствующее значение химич. строение краски, а также и метод ее применения. Не всякое окрашенное соединение есть краска, но если хромофорные группы в нем имеются (см.
Анилин,
анилиновые краски), то наибольшее значение имеет заряд, другими словами—реакция краски (основная или кислая); этим определяется также и метод ее применения. Некоторые краски окрашивают субстрат непосредственно. Другие краски неспособны к непосредственному действию и требуют предварительного протравления субстрата веществом, чаще всего неокрашенным, к-рое с одной стороны вступает в связь с субстратом, а с другой—собственно с краской. Т. о. получаются цветные лаки. При этом нередко сильно изменяется и цвет самой краски. В качестве протрав применяют различные соли алюминия, хрома, железа и др.; чаше всего пользуются их квасцовыми соединениями (см.
Гематоксилин).
Различают прогрессивную и регрессивную окраски. Прогрессивной окраской называют такую, при которой после красочной ванны препарат имеет уже окончательную степень окраски. Напр. основная краска Methylgriin в подкисленном растворе дает очень чистую окраску ядер, совершенно их не перекрашивая и не окрашивая протоплазмы. Прогрессивные окраски можно получить также и кислыми красками; они служат гл. обр. для выявления соединительнотканных волокон (это например Orcein по Unna, Fuchsin S-пикриновая кислота по ван-Гизону).—Р е-грессивная окраска всегда протекает в два стадия: 1) интенсивное и равномерное перекрашивание всего объекта и 2) ди-ференцировка препарата, которая заключается в удалении из среза излишней краски. Опыт показывает, что различные тканевые и клеточные структуры раскрашиваются неравномерно быстро; поэтому можно изолированно окрашивать какую-либо одну структуру. Пример регрессивного окрашивания—окраска железным гематоксилином по Гейденгайну. В зависимости от степени диференцировки, при этом методе можно получить окраску ядер, фибрил, клеточных оболочек, митохондрий и т. п.—Другими методами можно получить изолированную окраску эластических волокон, миелиновых оболочек нервных волокон, фибрина и т. д. Чрезвычайно распространено окрашивание препаратов во многие цвета (т. н. двойная, тройная окраска). Простейшим случаем будет диффузная докраска прогрессивно или регрессивно окрашенного препарата какой-либо кислой краской. Напр. после окраски гематоксилином, когда ядра имеют элективную синюю или черную окраску, протоплазму докрашивают кислыми красками: эозином, хромотропом и др. или смесью ван-Гизона (пикриновая кислота и фуксин). Многокрасочные препараты можно получить применяя (прогрессивно или регрессивно) смеси многих красок. Гомогенные смеси содержат либо одни кислые краски, например смесь Унна «WEP» (Wasserblau, Eosin, Phloxin), окрашивающую прогрессивно в голубой цвет—оболочки, в красный цвет—ядрышко и в тёмнокрасный—хроматин, либо одни основные, например его же смесь Methylgrun-Pyronin, применяемую регрессивно; результат окраски—зеленый хроматин, красные ядрышки и красная базо-фильная протоплазма. — Гетерогенные смеси составляются из основных и кислых красок. В качестве примеров можно привести смесь Бионди-Эрлих-Гейденгайна, состоящую из одной основной и двух кислых (Methylgriin, Fuchsin S, Orange G), и краску Гимза, составленную из двух основных и одной кислой красок (Methylenblau, Azur I, Eosin). В смеси краски не остаются индифе-рентными друг к другу, а дают соединения, легко выпадающие из раствора. Такие смеси кислых и основных красок называют иногда нейтральными смесями. Окраску можно производить не только на срезах, но и на целых кусочках ткани до заключения их в среду для резки. Т. о. получаются уже готовые окрашенные срезы. Прокрашивание кусочков можно конечно комбинировать с дополнительной до-краской срезов. Методы тотальных окрасок применяются гл. обр. при зоологических и эмбриологических работах. Наиболее излюбленной краской в этом отношении являются борный и квасцовый кармины и ге-малаун. Описанным комбинированием различных кислых и основных красок, а также протрав исчерпываются главные методы гист. окрасок. От
носительно специальных методов окраски см. ниже—гистохимия. Методы импрегнации металлами не являются окрасками в собственном смысле этого слова, хотя и служат для тех же целей гистолог, и цитолог, диференцировки. Принцип импрегнации основан на том, что различные органоиды удерживают соли нек-рых тяжелых металлов в очень различной степени. Практически поступают так: кусочки помещают в растворы этих солей, а через известный промежуток времени соли восстанавливают до металла. Пример импрегнации—серебрение клеточного аппарата Гольджи (см.
Голъджи метод)
по Рамон-и-Кахалу (Ramon у Cajal). Методы импрегнации разработаны гл. обр. для нервной ткани (см.
Нервные клетки, Белъшовского метод);
они очень многочисленны и часто очень сложны, но в принципе остаются теми же. Окрашенный или импрегнированный срез должен быть заключен в просветляющуюся среду с целью пропитать препарат средой, имеющей коеф. преломления, близкий к стеклу, и устранить так. обр. лучерассея-ние. Для этого применяются: глицерин, глицерин-желатина, гумми-арабик, левулеза, различные масла; наиболее распространено заключение в канадский бальзам. Последовательность заключения препарата в канадский бальзам такова: после окраски препарат переводится через спирты возрастающей крепости в абсолютный спирт и наконец в чистый ксилол; затем на препарат наносится капля бальзама, и препарат закрывается покровным стеклом. Толщина стекла не должна превосходить 150
fi,
т. к. иначе объективами микроскопа с малым фокусным расстоянием не удастся исследовать объект. Если препарат заключают в среду, растворяющуюся в воде, никаких промежуточных сред не нужно. Гумми-арабик или глицерин-желатина наносятся на срезы сразу после окраски и промывки препарата. Теоретические основы Г. т. Фиксация. Зафиксировать ткань, абсолютно ее не изменив,—задача конечно невыполнимая. Поэтому нужно стремиться зафиксировать так, чтобы структурные изменения можно было учесть. При изучении же тонких структур клетки этого достигнуть очень трудно, и поэтому желателен контроль путем прижизненного наблюдения. При фиксации, приводящей обычно к полной и необратимой коагуляции протоплазмы, всегда необходимо считаться с артефактами потому, что при этом вызывается изменение физ. состояния коллоидов клетки, при чем изменяется их дисперсность, и наступает разложение лио-фильных смешанных коллоидов. Морфологический характер коагулята протоплазмы
ГИСТОЛОГИЧЕС»
определяется с одной стороны ее коллоид-но-хим. свойствами, а с другой—свойствами примененного фиксатора. Т. о. микроскоп. строение фиксиров. протоплазмы является по существу артефактом и лишь в весьма условной степени отражает ее морфологию в живом виде. Вследствие этого только сравнительное изучение действия различных фиксаторов на данную протоплазму и ее строения в живом неизмененном состоянии может дать представление об ее истинной структуре. С неизбежностью таких артефактов необходимо считаться не только при оценке тончайших цитолог, наблюдений, но и в чисто гист. вопросах, т. к. под влиянием фиксаторов и последующей обработки в средах ткани могут набухать или сжиматься. Так, на основании точных измерений установлено напр. что после фиксации в жидкости Мюллера селезенка набухает на 19%, после проведения по спиртам размер ее но сравнению с исходной величиной увеличен на 10%, а после заключения в парафин она оказывается сжавшейся на 21% по сравнению с начальной величиной (В. Берг). Подобных примеров можно привести много. Поэтому крайне желателен контроль одного фиксатора другим фиксатором иного состава.— Первой группой фиксаторов являются такие, которые не вступают с тканью в химич. соединение, как напр. спирты и ацетон, мало изменяющие природу белков. Здесь коагуляция происходит в результате обезвоживания коллоидов. Сюда же может быть отнесена и термическая коагуляция—фиксация кипящей водой и высушивание мазков крови, бактерий и т. п. на пламени горелки или на медной пластинке при 120° (по Эрли-ху). Однако эти агенты применяются очень редко, так как они дают значительные артефакты (применяются гл. обр. в гематологии и бактериологии). Гораздо употребительнее фиксация путем химич. коагуляции, когда фиксатор вступает в связь с веществом ткани. Соединения эти с хим. стороны изучены мало, так как все фиксаторы введены и разработаны чисто эмпирически. Теоретически для фиксации можно употреблять все вещества, способные коагулировать белки, практически же пригодными оказываются только немногие, т. к. большинство дает
слишком грубые коагуляты, разрушающие биоструктуры. Напр. соли меди совершенно не нашли себе применения в качестве фиксаторов, несмотря на то, что они очень быстро и энергично коагулируют белки. Т. о. первым требованием, к-рое предъявляется к фиксатору, является то, чтобы он давал мелкий, равномерный и компактный коагулят. Эмпирически было найдено, что лучшими фиксирующими веществами являются: осмиевая кислота, хлористая платина, хромовая кислота и двухромовокислый калий (все в подкисленном растворе). Вторым преимуществом этих веществ является их свойство фиксировать также жиры и липоиды. Это особенно важно, т. к. количество жироподобных веществ в животном организме в среднем равно 5% при 12—15% белка. Наконец третьим требованием, к-рое предъявляется к фиксатору, является его быстрое действие—быстрое умерщвление ткани и проникновение в ее глубокие слои, т. к. иначе в глубине фиксируемого кусочка происходит медленное отмирание, приводящее к распаду. Скорость проникновения фиксатора в ткани, являясь функцией скорости свободной диффузии, однако не строго пропорциональна с последней. Смешиваясь с белками, большинство фиксаторов связывается ими, и в этом случае диффузия неразрывно связана с процессами изменения физ. состояния и хим. природы фиксируемого вещества. Вследствие этого фиксатор оказывает как бы «мем-браногенное» действие, которое крайне затрудняет дальнейшее проникновение фиксатора в ткань. По мнению нек-рых особенное значение при этом имеют освобождающиеся на границе липоиды, и чем легче фиксатор их растворяет, тем быстрее идет его проникновение. С этой точки зрения получает истолкование то обстоятельство, что в большинство фиксаторов входит как обязательная составная часть уксусная к-та, легко разрушающая и поэтому удаляющая липоиды и очень быстро проникающая в ткани. Уксусная кислота как бы ведет за собой другие вещества, которые иначе проникали бы в ткани лишь с большим трудом. Конечно имеет значение и то обстоятельство, что уксусная кислота сама легко осаждает белки и поэтому, если даже фиксирующие агенты смесей имеют чисто парциальное действие, то трудно проникающие в живую протоплазму вещества значительно легче будут диффундировать в осажденный коллоид. Ниже дается таблица, в к-рой приведена сравнительная скорость проникновения фиксаторов в ткань селезенки через 12 часов воздействия при 20° (по Теллесницкому): 0,3%-ная хлористая платина. 0,5
мм
0,75% » пикриновая кислота. 1,5 » 2% » осмиевая » . 2,0 » 1% » хромовая » . 2,6 » 7,5% » сулема. 3,8 » 10% » формалин. 2,5 » 3% » двухромовокислый калий. 4,6» 96% » спирт. 3,5 . 5%
»
уксусная кислота. 5,5 » 5% » азотная » . 7,5 » Эмпирически уже давно пришли к выводу, что смеси фиксаторов действуют обычно гораздо лучше, чем одно какое-нибудь вещество. Подходя к этому вопросу со стороны скорости проникновения, приходят к тому же выводу: жидкость Флемминга (1 % Сг03— 15 ч., 2% Os04—4 ч., уксусной кислоты— 1 ч.)—4,8
мм;
жидкость Теллесницкого (3% К2Сг207—100 ч., уксусн. к-ты—5 ч.)—5,5лш. С химической стороны интересно, что Os04 и К2Сг207—два лучших фиксатора, сами белка почти не осаждают, в присутствии же уксусной или др. к-ты действуют очень энергично. В жидкости Ценкера (5% HgCl2,3%K2Cr207, 1% Na2S04, 1—5% уксусной кислоты) сходную роль играет глауберова соль (ее можно заменить повар, солью), сама по себе не являющаяся ни в коей мере фиксатором. Понять ее значение можно по аналогии с процессом дубления кожи хромовыми солями. Оказывается, что при хромировании кож этой же солью (К2Сг207) добавление указанных выше солей улучшает их качество (прочность); тотальный химич. анализ при этом показывает процентное увеличение связанного хрома. Наряду с переводом одних со – единений в нерастворимое состояние фиксатор может растворять другие вещества и т. о. удаляет их из тканей. Так, до сих пор напр. не найдено ни одного способа сохранения в гнет, препарате глюкозы. Вообще при всех водных фиксаторах, когда имеют дело с животными тканями, необходимо считаться с потерей углеводов. Чтобы сохранить гликоген, употребляются фиксаторы, содержащие не менее 50% спирта, но тогда удаляются жиры и липоиды, которые имеют гораздо большее значение в смысле сохранности структуры. Жиро – и липоидо-растворяющими фиксаторами являются также уксусная к-та, хлороформ и др. В силу этого наилучшими, фиксаторами являются смеси хром-осмиевых солей, к-рые переводят в нерастворимое соединение как белки, так и липоиды. Наконец и белки могут подвергаться частичному растворению. Фик